Одной из основных задач генной инженерии является получение белков с заранее заданными свойствами. Для решения этой задачи необходимо уметь направленно изменять мельчайшие составные части генов – отдельные пары нуклеотидов молекулы ДНК. Такие операции c самой большой молекулой стали возможными сравнительно недавно и связываются в сознании обычного человека с ультрасовременными лабораториями, оборудованными сложными и дорогими приборами. Читая о современных достижениях генной инженерии, наверное, мало кто предполагает, что выделить и потрогать довольно чистый препарат «святая святых» жизни – ДНК – можно не только в специальных лабораториях, но и в домашних условиях. Экспериментируя, вы сможете усовершенствовать и изменить предлагаемые процедуры и узнать много нового об одном из важнейших компонентов клетки.
Нативная цепь молекулы ДНК может содержать несколько миллионов атомов. В водном растворе цепи ДНК несут слабый отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга. Если в растворе в достаточном количестве присутствуют положительно заряженные ионы, они притягиваются к цепям ДНК и нейтрализуют их заряд, в результате чего цепи ДНК могут слипаться. Таким образом, изменяя концентрацию соли, можно заставить отдельные фрагменты ДНК диссоциировать или, наоборот, объединяться. Это явление и лежит в основе методов выделения ДНК из клеток.
Почти все необходимое для выделения ДНК вы сможете найти на кухне. Сначала надо приготовить буферный раствор (буфер). Налейте 120 мл воды в чистую стеклянную емкость, добавьте 1,5 г (1/4 чайной ложки) поваренной соли, 5 г (1 чайную ложку) питьевой соды. В буфер надо добавить немного детергента – 5 мл (1 чайную ложку) шампуня или жидкого средства для стирки. Можно попробовать какие-нибудь другие детергенты, например средства для мытья посуды, но туалетное мыло лучше не использовать, т.к. в нем содержится большое количество добавок. Детергент выполняет две функции: разрушает клеточные стенки и способствует расщеплению крупных белков, которые иначе могут выделиться вместе с ДНК. Для того чтобы замедлить деградацию выделенной ДНК, буфер перед началом опыта охлаждают в кастрюле или любом другом сосуде, наполненном смесью колотого льда с солью.
Для приготовления буфера лучше использовать очищенную поваренную соль и дистиллированную воду, но подойдут также йодированная соль и покупная вода в бутылках или фильтрованная вода. Водопроводную воду из-под крана лучше не использовать.
В качестве источника ДНК подойдут овощи или фрукты. Хорошие результаты получаются с луком, чесноком, бананами и томатами. Но вы можете попробовать какой-нибудь другой фрукт или овощ. Возьмите его, разрежьте на мелкие кусочки, поместите в подходящий по размерам чистый сосуд, добавьте немного воды и тщательно измельчите до однородного состояния миксером с ножами (блендером), включая его несколько раз на 10 с с небольшими перерывами. Если нет миксера, можно использовать давилку для чеснока. При такой обработке клетки отделяются друг от друга, что способствует более эффективному действию детергента.
Поместите 5 мл полученного пюре в чистую емкость, добавьте 10 мл охлажденного буфера. Полученную смесь энергично перемешивайте в течение не менее 2 мин – в это время происходит разрушение клеточных стенок детергентом и выход содержимого клеток в раствор. Далее нужно отделить раствор, содержащий ДНК и другие молекулы, от нерастворимых остатков растительного материала. Для этого лучше всего использовать центрифугу (сепаратор): смесь прокрутите на центрифуге на низкой скорости в течение 5 мин, а затем, стараясь не взбалтывать осадок, слейте в длинный узкий сосуд (например, в пробирку, прозрачный пузырек из-под лекарств и т.п.) не менее 5 мл надосадочной жидкости.
Если у вас нет центрифуги, можно отфильтровать раствор через обычный кофейный фильтр или полотно. Если вам повезет, крупные частицы, все-таки прошедшие через фильтр, либо осядут на дно, либо будут плавать на поверхности. Для получения чистого раствора слейте его верхний слой, подождите, пока осядут остальные частицы, и затем аккуратно слейте (или перенесите пипеткой) жидкость в узкий сосуд.
Полученный раствор содержит фрагменты ДНК и множество других молекул – РНК, белков, углеводов и т.п.
Для экстракции ДНК необходимо небольшое количество изопропилового спирта (изопропанола, ИПС), предварительно сильно охлажденного в морозильнике. Используйте чистый изопропанол (без красителей и отдушек) в самой высокой концентрации, какую только удастся достать (обычно его продают в концентрации не ниже 70%). При помощи соломинки для коктейлей аккуратно нанесите 10 мл охлажденного спирта на поверхность раствора ДНК. Для этого погрузите соломинку в сосуд со спиртом и зажмите верхнее отверстие, затем опустите нижний конец соломинки в пробирку с раствором, прикоснитесь соломинкой к стенке и, слегка наклонив пробирку, позвольте спирту медленно стечь по стенке. Не набирайте спирт в трубочку (или пипетку) ртом! Если вы все сделали правильно, спирт, плотность которого меньше плотности буфера, останется на поверхности раствора.
Поместите тонкую стеклянную или деревянную палочку, например карандаш, в раствор таким образом, чтобы ее кончик оказался непосредственно под границей между буфером и спиртом, и очень осторожно в течение 1 мин поворачивайте попеременно в разные стороны. При этом наиболее длинные фрагменты ДНК накрутятся на палочку. Затем вытащите палочку – спирт заставит ДНК прилипнуть к концу палочки, и вы увидите на нем прозрачный вязкий осадок.
Конечно, в результате этой простой процедуры нельзя получить чистый препарат ДНК. В лаборатории в буфер добавляют ферменты, разрушающие млекулы РНК, которые иначе могут выделиться вместе с ДНК.
Даже после самой тщательной экстракции часть ДНК останется в растворе, образуя в нем невидимую паутину. При небольших дополнительных усилиях этот материал тоже можно увидеть. Некоторые красители, например метиленовый синий, связываются с заряженными фрагментами ДНК. Для окраски нитей, образованных оставшейся в растворе ДНК, достаточно добавить в него микроскопическое количество красителя – его молекулы свяжутся с ДНК, оставляя раствор неокрашенным. Возможно, для этой цели подойдут какие-либо пищевые красители или краски для тканей или волос – экспериментируйте!
По материалам
Scientific American,
сентябрь, 1998
ДНК-тест на отцовство – популярный вид медицинских анализов, который позволяет точно установить, кто является биологическим папой ребенка. Если мама малыша точно знает, что является ему родной, то отцам иногда этот факт не кажется очевидным. В такой ситуации исследование и помогает выяснить, чьи гены унаследовало чадо. Как же проводится тест и какая цена ДНК-теста на отцовство?
Вконтакте
Причины для проведения исследования ДНК могут быть и драматичными, и обыденными. Есть несколько распространенных ситуаций, в которых такие обследования необходимы:
- Судебные разбирательства по семейным вопросам (алименты, права наследования). В случае если отец или родственники семьи сомневаются в том, что ребенок является его собственным, могут потребоваться доказательства. ДНК-тест такие факты предоставляет.
- Генетические заболевания. В современном мире структура семьи может быть очень нетрадиционной. Иногда родители в курсе, что малыш может быть не от законного супруга, но не спешат с выяснением истинного биологического родства.
А если выясняется, что у малыша или отца есть генетическое заболевание, тогда проводятся пробы, чтобы выяснить, каковы перспективы его лечения.
- Ситуации после изнасилования. Порой следствием группового изнасилования является беременность. Это трагичная ситуация, но иногда и матери стоит выяснить, чьи гены носит ребенок.
Бывает так, что никаких экстренных ситуаций не возникает. Ни судов, ни конфликтов в семье нет. Но у кого-то из родственников семьи возникают сомнения в том, кто отец ребенка. Для успокоения души также можно сделать ДНК-тест на отцовство.
Как выглядит бланк и где сделать тест
Поскольку пробы на ДНК проводят чаще всего в ситуации конфликта, то оформлять его результаты принято особым образом. Без соблюдения некоторых формальностей суд может не признать документ пригодным для принятия решения, анализы придется сдавать снова.
Как оформляется бланк:
- Бланк. Результаты предоставляются на фирменном бланке лаборатории или медицинского центра.
- Печать. Данные подкрепляются печатью организации, проводившей анализ биологического материала.
- Результат. Если тест отрицательный, вероятность отцовства равна 0%. Если тест положительный, то вероятность отцовства конкретного мужчины, сдавшего материалы на тест, равна 99,9%.
- Генетический паспорт. В заключение экспертов должна содержаться информация о структуре ДНК, уникальная для каждого человека.
В большинстве клиник такие бланки и способы их заполнения являются типовыми. Если у учреждения имеется лицензия на проведение тестов, то результаты принимаются судом в качестве доказательства отцовства или его отсутствия.
Посредством теста на ДНК – не самая дешевая процедура. Она стоит от 5 до 80 тысяч рублей. На стоимость теста ДНК на отцовство влияет множество факторов:
Консультация с врачами и специалистами из лабораторий поможет выбрать нужный вариант тестирования, оптимизировать затраты на проведение анализа.
Поскольку сделать ДНК-тест на отцовство стоит дорого, его можно проводить и в домашних условиях. Но они не принимаются к рассмотрению в судах. К сожалению, процедура пока непростая. Она не похожа на ту, которая применяется для установления факта беременности.
Домашние тесты на отцовство с использованием ДНК-анализа подразумевают несколько шагов:
- Заказ набора для сбора материала. Обычно это инструменты для получения мазка из ротовой полости.
- Отправка полученных материалов в лабораторию.
- Получение результатов.
Этот вариант проведения теста считается относительно недорогим, потому что используются стандартные биологические материалы, не требуется пакет документов для суда или посольства. Проведение теста возможно анонимно, наборы никак не маркируются, чтобы не выдать намерения инициатора. К наборам прилагается подробная инструкция, ошибиться с выполнением сбора материалов сложно.
Как расшифровать результаты
Расшифровкой результатов занимаются лаборатории, которые проводят ДНК-тестирование. Обычно они предоставляют их в стандартной форме на фирменных бланках.
Результаты могут быть трех видов:
- Отрицательный. В этой ситуации мужчина, как вероятный отец, на 100% исключается из числа «подозреваемых».
- Положительный. Обычно указывают, что пациент является отцом на 99,9%. Существует мизерная вероятность, что в мире есть два человека с одинаковым геномом. У однояйцевых близнецов он, к примеру, идентичный. Судом такой тест учитывается, как положительный.
- Неопределенный. Такое тоже бывает, если качество биологического материала оказалось не соответствующим некоторым нормативам. Правда, такое случается редко, особенно если сдача материалов проводилась в стенах лаборатории с участием медицинского работника.
Оплата проводимого теста проводится заинтересованной стороной, если дело не доходит до суда. В последнем случае, платит обычно тот человек, который подал иск. Но иногда по решению суда оплату экспертизы назначают проигравшей стороне.
Как правильно подготовить материал для ДНК-теста на отцовство, и получить результаты, смотрите на видео:
Вконтакте
ДНК в домашних условиях
Наследственность, гены, ДНК... Кажется, эти слова уже давно перестали быть научными терминами, вошли в повседневную жизнь и знакомы теперь каждому старшекласснику, не говоря уж о студентах. Но никакой ДНК большинство из нас никогда не видело, хотя увидеть ее - дело вполне реальное даже в домашних условиях. В одной из генетических лабораторий на стене висит, к примеру, вот такая инструкция:
Как самому выделить ДНК.
1. Возьмите что-то, что содержит много ДНК. Например, фасоль (но можно свиную печень, рыбные молоки или редиску).
2. Положите в миксер около 100 мл (полстакана) этого продукта, добавьте 1/8 чайной ложки соли и 220 мл (стакан) холодной воды. Взбивайте в течение 20 секунд. Миксер «сварит» вам фасолево-клеточный суп.
3. Процедите смесь через ситечко или кусок марли или капрона (чулок вполне подойдет).
В полученную мякоть добавьте 1/6 от ее количества (это будет примерно 2 столовые ложки) жидкого моющего средства (для посуды, например) и хорошо размешайте. Оставьте на 8-10 минут.
4. Разлейте жидкость по стаканам или другим стеклянным посудинам, чтобы в каждой было заполнено не больше 1/3 объема.
5. Добавьте в каждую пробирку по чуть-чуть либо сока, выжатого из ананаса, либо раствора для контактных линз и осторожно встряхните, переворачивая и наклоняя пробирку (если будете трясти слишком рьяно, разломаете ДНК и ничего не увидите).
6. Наклоните пробирку и медленно влейте в нее немного этилового спирта, чтобы он образовал слой поверх фасолевой смеси. Лейте, пока спирта и смеси не окажется поровну. ДНК всплывет наверх в виде хлопьев.
7. Деревянной палочкой (карандашом) выловите их и рассмотрите под микроскопом.
Для научных работников эта инструкция - в какой-то степени шутка и никто из них ДНК таким способом не выделяет, а между тем если и вправду воспользоваться ею, то все получится! Выход ДНК будет, правда, невелик, а вещество - не особенно чистым, но увидеть в микроскоп длинные тонкие нити - кристаллы ДНК - вполне возможно.
Что же происходит с фасолью или свиной печенью в процессе описанных манипуляций и почему в конечном счете ДНК оказывается отделенной от всех остальных веществ, которых в клетке великое множество?
1.Выбор объекта.
ДНК, как известно, есть в каждой клетке, а значит, выделить ее можно из любой ткани - даже из костей животных, чешуи рыб или древесины, где клеток не так уж много по сравнению с объемом внеклеточного вещества.
Во всех тканях организма как животного, так и растения, ДНК, как правило, одинакова. Отличаются эти ткани тем, что в одних из них помимо вещества наследственности больше почти ничего нет (молоки селедки), а в других, таких, как костная ткань, содержание ДНК относительно невелико.
В общем, если перед исследователем не стоит какой-то специальной задачи, он старается выбрать для работы ткань, в которой мало межклеточного вещества и много самих клеток. Причем желательно, чтобы ткань легко распадалась на эти составляющие, а клетки не были перегружены белками (как мышечные), липидами (как жировые) или полисахаридами (как клетки мозга).
2. Дробим ткань на клетки.
В миксере ткань, из которой мы собираемся добыть вещество наследственности, распадается на отдельные клетки: чтобы механически разорвать связи между ними требуется, как правило, гораздо меньше усилий, чем для того, чтобы повредить саму клетку. И поскольку при нашем способе выделения ДНК требуются более или менее целые, неповрежденные клетки, ясно, что консервированный горошек, кукуруза или соленая селедка для такого эксперимента не годятся, - лучше уж взять что-нибудь свежезамороженное, если вы уверены, что продукт не размораживали в процессе хранения несколько раз.
А немного соли нужно добавить в раствор для того, чтобы клетки не полопались раньше времени: давление внутреннего содержимого на клеточную мембрану изнутри уравновешивают давлением соляного раствора снаружи.
3. Высвобождаем макромолекулу
Что касается фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически удалить из клеточной суспензии всевозможные примеси, в том числе, крупные куски ткани - все равно те вещества, которыми мы собираемся обрабатывать смесь, не смогут проникнуть глубоко внутрь таких конгломератов, и для выделения ДНК они окажутся бесполезными.
А обработать
полученные клетки следует, в первую очередь,
каким-нибудь детергентом. Средство «Ферри», способное,
согласно рекламе, легко отмыть самую жирную посуду,
годится и для того, чтобы наделать больших дырок в
липидной мембране как самой клетки, так и ее ядра. Если
нет жидкого моющего средства, можно сделать
концентрированный раствор стирального порошка - тоже
подойдет.
В результате такой обработки все клеточное содержимое
вывалится наружу и окажется в растворе, который
сделается при этом очень вязким, тягучим и существенно
более прозрачным, чем была клеточная суспензия.
Изменение консистенции раствора - верный знак того, что
лизис прошел успешно.
4. Тут все ясно и без комментариев -
не наливайте слишком много раствора в емкость, туда предстоит еще много чего налить, к тому же, если смеси будет в избытке, ее будет трудно перемешать.
5. Освобождаемся от белков
Чего только нет в нашей смеси! Однако белков здесь - больше всего, причем именно они образуют самые прочные комплексы с ДНК. Существуют методики, когда белки удаляют из раствора в несколько этапов. Например, часть из них легко денатурирует и выпадает в осадок при добавлении концентрированных растворов солей. В лабораторных условиях такие приемы прекрасно работают, а от осадка исследователи освобождаются, помещая пробирки на несколько минут в центрифугу.
Мы сразу же перейдем к очистке ДНК от остаточных белков с помощью специальных ферментов, способных разрушать эти молекулы. Именно такие вещества содержит сок ананаса. Сами они - тоже белки, поэтому ананас, из которого выжимают сок, должен быть свежим: у ферментов нет ни малейшего шанса сохраниться неизменными в компоте или в консервированном продукте. Что же касается раствора для очистки линз, то если вы собираетесь использовать его - не забудьте положить таблетку для удаления белковых отложений! Сами по себе растворы для хранения контактных линз никаких активных веществ не содержат - иначе и нашим глазам не поздоровилось бы.
О том, что ферменты сработали, можно судить по уменьшению вязкости раствора. Если этого не происходит, поместите смесь в теплое место (примерно 37C) на полчаса, иногда может потребоваться добавить больше ананасового сока или раствора для очистки линз.
6. Осаждаем ДНК из раствора
Теперь ДНК плавает в растворе сама по себе. Белки больше не цепляются за нее, хотя обломков всевозможных молекул в смеси по-прежнему много. В лабораторных условиях эти ненужные фрагменты убирают, тщательно перемешивая раствор с фенолом и/или хлороформом. После центрифугирования внизу пробирки оказываются фенол и/или хлороформ с растворенными в них белками, а вверху - водная фаза, содержащая ДНК. Водную фазу собирают в отдельную пробирку и дальше работают уже с относительно чистым раствором.
За неимением центрифуги и органических растворителей, работа с которыми требует к тому же специальных мер безопасности, этот этап очистки в домашних условиях приходится пропустить и осаждать ДНК прямо из «грязного» раствора.
Заметим сразу -
заменить этиловый спирт водкой или духами нельзя: если
концентрация спирта будет низкой и упадет при смешивании
с водной фазой до 60-65%, ДНК в кристаллическое
состояние не перейдет.
Отчасти именно по этой причине наливать спирт в пробирку
с ДНК-содержащей смесью следует осторожно, наслаивая его
сверху. Тогда нижние слои спирта частично смешаются с
раствором ДНК, начнется процесс кристаллизации
нуклеиновых кислот, и они всплывут на поверхность (где
спирт более концентрированный) в виде хлопьев.
Если же налить спирт сверху не получится и все безнадежно перемешается, то при малом количестве этанола у вас вообще ничего не получится, а при большом начнет кристаллизоваться не только ДНК: в осадок выпадут и остатки белков, и кое-что еще из исходного содержимого клеток.
7. Что же мы получили? (см.рисунок ниже)
Чистые кристаллы ДНК похожи на клубки спутанных нитей, но не надо забывать, что вы видите именно кристаллы вещества, а не его макромолекулы, и сказать по их внешнему виду, какие гены содержит выделенная вами нуклеиновая кислота, конечно, невозможно. Чтобы узнать это, придется снова растворять ДНК. Впрочем, «прочесть» последовательность нуклеотидов в домашних условиях, увы, невозможно: для этого нужны не только специальные приборы, но и дорогие реактивы.
Однако если вы уже хорошо рассмотрели кристаллы и они успели подсохнуть, можете понаблюдать за тем, как ДНК растворяется. Она в начале набухает, становясь похожей на студенистую медузу, и лишь спустя несколько дней раствор делается однородным.
Процесс можно ускорить, если пробирку почаще встряхивать.
Желаю успехов начинающим генетикам и молекулярным биологам!
Материал подготовил: учитель биологии НОУ СОШ «ВЕНДА» Ледуховский Н.В.
«Не похожий на тебя, не похожий на меня..?» - как не выкинешь слов из песни, так и закрыть глаза на печальную статистику вряд ли удастся. Как показывают исследования в Великобритании каждый 25 мужчина воспитывает генетически не родного ребенка, даже не подозревая об этом. Конечно, хочется верить, что в нашей стране ситуация более радужная, хотя резко увеличившееся количество супружеских пар, которые желают и пройти экспертизу ДНК, не очень обнадеживает.
Сегодня, получить информацию об отцовстве могут все сомневающиеся мужчины, благодаря гениальному изобретению - домашнему тесту ДНК. Что это за анализ, что нужно для его проведения и какова достоверность полученного результата, мы расскажем вам в этой статье.
Тест на отцовство в домашних условиях
Впервые услышав об анализе ДНК на отцовство в домашних условиях, многие представляют себе нечто на подобии мини-лаборатории или приспособление типа теста на беременность. Но нет, на самом деле домашним тест ДНК на отцовство называется только потому, в домашних условиях проводится забор биоматериала, который в дальнейшем направляется в лабораторию. По сути это специальный набор, состоящий из стерильных палочек, разноцветных конвертов и видео-инструкции с подробным описанием, как правильно провести процедуру забора клеток (буккального эпителия) с внутренней поверхности щеки. Забор биологического материала обязательно проводится у предполагаемого отца и ребенка, клетки матери упрощают исследование, но обязательными не считаются. Получив буккальный эпителий, его помещают в специальный конверт и отправляют в лабораторию, где непосредственно проводится сопоставление ДНК отца и ребенка.
На проведение анализа уходит несколько (2-5) дней. Результаты сообщаются непосредственно заказчику, поскольку являются конфиденциальной информацией, не подлежащей разглашению третьим лицам и государственным организациям. Точность данного исследования составляет практически 100%. Также стоит уточнить, что для проведения теста ДНК на отцовство в домашних условиях необходимо письменное согласие матери, отца и ребенка (после 16 лет).
Несомненно, такая доступность проведения вызвала шквал противоречивых отзывов. С одной стороны, это возможность, каждому сомневающемуся мужчине установить родство с ребенком, с другой – недоверие подобного плана может стать причиной развода. Именно поэтому решение пройти тест на отцовство должно быть взвешенным и обоюдным.
